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    高效液相色譜儀操作“三要點”
    發布時間:2024-05-31       瀏覽人次:0

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            高效液相色譜儀(HPLC)現已成為有機化學分析的重要手段之一。同樣,在食品分析中,無論是殘留分析還是成分分析,HPLC也已成為不可或缺的分析儀器。和其它分析儀器一樣,你若想讓HPLC很好地為你工作、得到可靠的數據,首先你要保養好它,使它處于一個良好的待機狀態,這樣你操作它進行分析時就可以比較順利地獲得理想的結果。而且良好規范的操作習慣可以延長儀器使用壽命。大家在學?;蚪邮軆x器公司培訓的時候,老師或工程師會提出很多的操作注意事項。但要是總結歸納一下,最重要的有三點:脫氣、過濾和沖洗。本文圍繞這三點進行討論,給新從事HPLC分析的工作者一點操作建議,希望能對正確的操作儀器有一點幫助。更歡迎有經驗的專家介紹使用經驗,提出好建議。

    一、脫氣

          流動相脫氣對于避免HPLC系統出問題,順利得到一個理想的數據是一個很有效的措施。HPLC系統內是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時要產生很大的力量,由于氣體的壓縮比與液體相比大的多,因而當氣泡存在時,你將觀察到瞬間的流速降低和系統壓力下降。如果這個氣泡足夠大,液相泵將不能輸送任何溶劑,而且如果壓力低于預先設定的壓力低限,泵將停止工作。有些泵設計可以很好地排除氣泡,而也有一些泵設計當氣泡存在時將停止運轉。當一個氣泡通過輸液泵時,由于系統壓力大,氣泡通常會溶解在流動相溶液中,隨流動相通過柱子。但是到達檢測器流通池時系統壓力又恢復到了大氣壓,因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現,在色譜圖上會出現不規律的毛刺。為解決這個問題,有些儀器公司設計一個反壓控制器,這樣可以在檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動相中直到它們流出檢測器。當然,這個壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限,否則可能損壞檢測器。紫外/可見光(UV/VIS)檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進入并通過流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感,但表現出的征兆與UV/VIS不同,例如有報導說,當使用熒光(FL)檢測器時,流動相中溶解氧的存在可能會使一些化合物失去熒光性。此外,對于利用待測物質在電極表面發生氧化還原反應引起電流變化而進行檢測的電化學(EC)檢測器,對流動相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外,氣泡的存在有時還會導致保留時間不重現。所以,必須注意消除流動相中的空氣,并且還應避免空氣由管路(如PTFE管)滲透進流動相中。如果適當地關注在使用之前脫去流動相中溶解進的空氣,上述這些問題均能避免,或把影響降至最低。常用的脫氣方法有如下幾種:1、吹氦脫氣法:利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性,在0.1MPa壓力下,以約60 mL/min流速通入流動相儲液容器中10~15min,可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣,能排除接近80%的氧氣。采用一個高效分布式噴射流裝置,一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好,但我們國內氦氣價格較高,很少有實驗室采用此方法。2、 加熱回流法:此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率,否則溶劑會丟失,混合流動相的比例會有變化。3、 抽真空脫氣法:此法可使用真空泵,降壓至0.05~0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發生變化,從而影響到實驗的重現性,因此多用于單溶劑體系的簡單分析。4、超聲波脫氣法:將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中,用超聲波震蕩10~20min。此法的脫氣效果zui差。5、 在線脫氣法:現在商品的HPLC儀器,均可配在線脫氣機。在線脫氣使用簡單,低故障,有效。建議購買儀器時一定要購買,有的公司是作為選購件,所以與儀器公司談配置時應與公司確認。

    二、過濾

          任何顆粒物進入HPLC系統后都會在柱子入口端被篩板擋住,zui后的結果是將柱子堵塞,表現出的特征是系統壓力增加并使色譜峰變形。因此,要采取各種預防措施,包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設計,努力防止或減少顆粒物進入HPLC系統中,從而延長儀器和色譜柱的使用壽命,并提高數據的可靠性。在HPLC系統中,顆粒物的主要來源有三個途徑:流動相、被測樣品和儀器系統部件的磨損物。

          1、流動相如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成,流動相沒有必要過濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑,例如乙腈、甲醇等,在制造的工藝過程中都已經過了0.2 μm微孔濾膜過濾。同樣的,無論你是買的HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統制備的水,zui后一步也是通過0.2 μm微孔濾膜。然而,如果有任何一種緩沖液中加入了固體物,例如磷酸鹽,流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的,但它還是可能含有顆粒物質,例如在蓋試劑瓶的塑料內蓋時,塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產生塑料顆粒。在這種情況下,添加的一種固體物可能完全溶解了,但是少量雜質顆粒存在于流動相中成為殘渣。流動相通過0.45 μm微孔濾膜過濾對于從流動相中除去所有顆粒物是一個有效方法。0.2 μm微孔濾膜也可以用,但是它們就這個應用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效,而且它的過濾速度會更慢,特別是當實驗室使用的試劑和水的質量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們流動相制備標準操作程序(SOPs)時規定,可以借鑒國際上同類實驗室的規定,即:流動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾,反之所有流動相組成在使用前必須過濾。在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器(常見材質有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個過濾器的規格為≥10 μm的微孔物質,所以它不能取代流動相過濾步驟,但是它能除去系統中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。

         2、被測樣品液相系統中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤(或手動進樣)以前,所有樣品都先通過一個0.45 μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點需要關注:你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品,總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面:過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失,過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎?這個問題一般需要通過實驗確認。確認這步是要增加工作量和費用的。過濾器的使用是一種消耗,每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時,由于基質大多比較復雜,所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實際分析工作中,一般檢測每一組樣品會帶一個外標、一個添加回收或是質控樣品,所以,只要zui終檢測時得到的信噪比能滿足檢出限要求,可將這步視為系統誤差而忽略。

         3、儀器系統部件的磨損物最后,在HPLC系統中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉軸的磨損。關于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。一種建議認為,在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年,因此建議半年或一年更換這些密封墊,實驗室應基于上述觀點制定定期預防性維護計劃。該觀點認為:與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相比,更換密封墊的費用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網,可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物,防止這些顆粒物隨流動相流至柱頭。若有這種裝置應查閱輸液泵操作手冊,查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。另一種建議則認為,原裝密封墊的密封效果最好,更換以后容易引起流動相滲漏。所以,只要不漏液就不要輕易更換密封墊。兩種說法都有其道理,具體如何操作,建議與儀器公司工程師溝通,各公司的儀器還是有些不同的。自動進樣器旋轉軸的密封隨著使用時間也會磨損,但是在我的經驗中,即便是高負荷的運轉旋轉軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動進樣器系統有計數進樣閥轉動次數的功能,你可以設定一個警鈴當預設閥轉動次數已達到時提醒你。曾有一種說法,進樣器最多轉動20,000次,這僅僅是進樣10000個;但這似乎不是實驗室涉及的常規樣品分析使用壽命,它們的實際使用壽命會更長。旋轉軸密封磨損后會滲液,比較明顯的特征是同一樣品多次進樣后,峰面積值差別比較大(RSD>5%)。當然,輸液泵的密封墊和旋轉軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在流動相中,加速對這些部件的損傷。此外,如果你日常運行的流動相有緩沖鹽,如磷酸緩沖鹽,密封墊的磨損會更快。無論顆粒物源于何物,實驗時都要將其除去。推薦在HPLC系統中采用一個0.45或0.5 μm的在線多孔過濾器,接在自動進樣器和柱子之間,即使已使用了保護柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板,而且如采用一個玻璃砂芯濾板,既便宜,更換又方便(幾分鐘就可更換)。若采用在線過濾,HPLC系統檢測每批樣品開始前記錄下壓力值,當壓力上升一定值,例如25%或增加500psi,應該更換玻璃砂芯濾板了,更換以后沖洗幾分鐘系統將恢復到原來的壓力值。

    三、沖洗

          使HPLC系統良好運行的第三個要點是保持系統的清潔。你需要關注流動相流經該系統的所有地方,對于這些地方經常性的沖洗,將使你的系統保持在“Ready”狀態。

          1、流動相儲液瓶首先要經常清洗流動相儲液瓶,或者每做一批新樣品更換一次流動相。一個臟的儲液瓶將會污染注入的流動相。建議儲液瓶中緩沖液使用時間不要超過一周,而有機溶劑使用時間不要超過一個月。也有人建議儲液瓶中保持用溶劑充滿,直到更換分析方法儲液瓶需更換新溶劑(流動相組成發生變化)時,將舊溶劑倒掉更換新溶劑,這樣勝于將溶劑用完。但這對于分析樣品量少的實驗室而言似乎有些浪費。儀器公司的工程師建議儲水瓶的水要天天換,每周瓶子還應該用異丙醇清洗一次。有的實驗室則在水里加入0.1~1 mM的甲酸抑制微生物的生長。這些做法看起來有些繁瑣,但卻能起到“磨刀不誤砍柴工”作用。

          2、泵接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵,特別是當流動相中含有難揮發的緩沖液(如磷酸鹽)時。如果儀器不是連續使用,當流動相蒸發時,難揮發物就會粘在活塞密封墊的表面,難揮發物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以,無論使用長短,在停泵以前一定要用非緩沖液流動相沖洗泵在半個小時以上,要是流動相中有難揮發緩沖鹽則建議沖洗的時間應該更長些。

          3、自動進樣器自動進樣器也要按規定清洗?,F在的儀器多配有自動進樣器的沖洗液瓶,通常只要注意及時更換、補充沖洗液即可。自動進樣器用的洗滌液也要采用與流動相相同的方式處理,并根據溶劑的有效期和規定,清洗儲液瓶或更換洗滌液?,F在的自動進樣器設置、操作都很簡單,如果時間允許(特別是利用夜間運行),每次分析完后設置進1、2針純溶劑(如甲醇、乙腈),也是一個好做法。

          4、色譜柱 對柱子的污染是隨使用時間而增加。通常表現是:運行走基線時在記錄的色譜圖中基線噪音增加,泵壓也增加。解決這個問題的zui有效方法就是在每一批樣品分析結束后或準備卸下柱子時用大量的流動相沖洗柱子(例如,甲醇、乙腈和水)。用梯度沖洗效果更好,具體的比例要根據柱子的說明書和性質而定。

          5、檢測器如果是正常使用,檢測器將依據其性質并按照說明書規定進行洗。例如UV/VIS檢測器或FL檢測器,在對柱子和系統進行沖洗時也就一同對檢測器流通池中污染物進行了清洗。但是蒸發光檢測器或質譜儀則需要按照說明書進行定期清洗。這些檢測器在使用時會有難揮發污染物沉積,如質譜儀離子源的噴針、毛細管、錐孔板、預四極等部件,因而需要定期清洗。而且對聯有這些檢測器的系統沖洗時,最好與這些檢測器斷開,以減少對檢測器的污染??傊?,實驗室日常使用的液相色譜儀要是能認真做好這三項工作——脫氣、過濾和沖洗,你的儀器可以得到良好的預防性維護,使用時就會感到比較順手。當然,在實際操作時遇到的問題并沒有這么簡單,但這三個良好習慣將是正確操作、使用HPLC系統的基礎。


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